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所有数据点代表平均值 ± 标准差除非另有说明,所有实验重复至少3次。显示了代表性数据。统计学显著性通过使用 Graphpad Prism 6软件的方差分析和 Bonferroni 事后检验进行多重比较和两组学生的 t 检验来确定。P 值 < 0.05被认为是显着的。结果 AT101诱导 MPNST 细胞中半胱天冬酶非依赖性细胞死亡,使用 NF-1患者来源的 MPNST 细胞系(T265-2c,ST88-14和90-8细胞)评估 AT101对人 MPNST 细胞的作用。为了确定 AT101是否抑制 MPNST 活力,用5-20μMAT101处理细胞24-72小时,并使用钙黄绿素 -AM 切割测定评估细胞活力。我们发现 AT101以浓度和时间依赖的方式降低 MPNST 细胞活力(图1A-B)。我们证实该载体(DMSO)在使用浓度(1-4μl/ml 培养基)时对细胞活力没有影响(图1)。S1A,B).由于(-)-棉酚已被报道在癌细胞中诱导生长抑制[28] ,并且钙黄绿素 -AM 切割测定仅测量活细胞,我们通过流式细胞术测量处理的细胞中的乙锭同型二聚体 -1染色来评估 AT101诱导的细胞死亡。AT101处理导致乙锭同型二聚体 -1阳性死亡 ST88-14细胞百分比的浓度依赖性增加(图1C; 在另外两种细胞系中获得类似的结果; 数据未显示)。
图1。AT101引起 MPNST 细胞中半胱天冬酶非依赖性的非凋亡性细胞死亡。 AT101处理的细胞表现出浓度和时间依赖性的活力降低(A,B)。AT101处理在 ST88-14细胞中引起浓度依赖性细胞毒性(C)。细胞活力的丧失不伴随着半胱天冬酶 -3样酶活性的增加(D) ,BAF 广泛的半胱天冬酶抑制不能保护 AT101诱导的细胞死亡(E)。AT101(15μM,24小时)处理不增加 T265-2c 细胞中的膜联蛋白 V 染色(F)。以星形孢素(STS)为阳性对照,诱导半胱天冬酶 -3样活性、膜联蛋白 V 染色和半胱天冬酶依赖性细胞凋亡。* p-value < 0.05.# = 不显著,p 值 > 0.05。
由(-)-棉酚诱导的癌细胞死亡可以由半胱天冬酶依赖性或半胱天冬酶非依赖性机制引起[24] ,[29]。为了确定 AT101是否触发 MPNST 细胞中的效应半胱天冬酶活化,在裂解后在 AT101处理的细胞中测量活性效应半胱天冬酶(半胱天冬酶 -3,6和7)的药理学底物 devD-AMC 的切割。我们发现 AT101处理对 T265-2c 和 ST88-14细胞中半胱天冬酶 -3样的酶活性没有影响(图1D)。与这些结果一致,用广谱半胱天冬酶抑制剂 BAF 预处理不减弱 T265-2c 和 ST88-14细胞中 AT101诱导的细胞毒性,与其抑制星形孢菌素诱导的这些细胞死亡的能力相反(图1E)。为了进一步确定 AT101诱导的 MPNST 细胞死亡是否为凋亡,我们通过流式细胞术测定了处理的 T265-2c 细胞中膜联蛋白 V 和碘化丙啶染色。AT101处理不增加膜联蛋白 V 阳性细胞而增加碘化丙啶阳性细胞(图1F)。基于这些发现,我们得出结论,AT101通过半胱天冬酶依赖性凋亡以外的机制导致 MPNST 细胞死亡。在 MPNST 细胞死亡过程中 AT101触发的自噬不具有细胞保护作用
-)-棉酚先前已经显示在其他癌症类型中刺激自噬[30] ,[31]。然而,细胞保护作用和细胞毒作用都归因于(-)-棉酚诱导的癌细胞自噬[24] ,[31]。因此,我们首先询问 AT101是否也刺激 MPNST 细胞的自噬。对 AT101处理的细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹并探测 LC3 II 水平的变化,LC3 II 是一种被广泛接受的自噬空泡(AVs)的替代标志物[32]。与未经处理的对照组相比,AT101处理的细胞 LC3 II 的稳态水平显著增加(图2A)。我们通过进行免疫细胞化学来证实这一观察结果,这表明 AT101处理改变了 LC3样免疫反应性的细胞内分布,从相对较弱的弥散染色模式到与 T265-2c 细胞中增强的 AV 含量一致的强点状模式(图2B)。
图2。AT101诱导的 MPNST 细胞自噬不具有细胞保护作用。用 AT101处理导致 MPNST 细胞中 LC3-II 稳态水平的浓度依赖性增加(A)和指示 AV 积累的点状 LC3样免疫染色模式(B)。AT101引起 MPNST 细胞中自噬通量的增加,如用 AT101(10μM,24小时)和 BafA1(100nM,收集裂解物前4小时加入)处理的细胞中 LC3 II 水平的增加所证明的与单独的药物(C)相比。用3-甲基腺嘌呤(用 AT101处理前1小时3MA-5mM)处理的 T265-2c 细胞显示 LC3-II 积累水平降低(D)和 AT101(15μM,24小时)诱导的细胞死亡(E)。比例尺 = 20微米。* p-value < 0.05.
虽然 LC3 II 水平的增加表明 AV 的积累,这可以反映增加的自噬诱导和/或减少 AV 降解。因此,我们评估了在存在或不存在 Bafilomycin A1(BafA1)(一种阻断 AV 降解的液泡 ATP 酶抑制剂)的情况下用 AT101处理的 MPNST 细胞中的自噬通量[33]。我们观察到,与单独使用两种药物相比,用 AT101和 BafA1处理的细胞中 LC3 II 水平增加,表明 AT101刺激房室形成(图2C)。为了评估 AT101诱导的自噬在 MPNST 细胞中的功能作用,我们通过在暴露于 AT101之前用3-甲基腺嘌呤(3MA)(图2D)处理细胞来抑制 AV 形成。3MA 是一种 III 类磷脂酰肌醇3-激酶的抑制剂,这是启动自噬所必需的[34] ,[35]。我们发现3MA 对自噬的药理学抑制导致了 AT101诱导的 T265-2c 细胞死亡的适度但有统计学意义的减弱(图2E)。这些发现表明,AT101诱导的 MPNST 细胞自噬不具有细胞保护作用,并且可能发挥细胞毒性作用。 BNIP3介导 MPNST 细胞中 AT101诱导的细胞死亡 BNIP3是参与细胞死亡,自噬和线粒体清除的非典型 BH3-only 蛋白[36]。BNIP3可以介导非凋亡形式的细胞死亡,这是半胱天冬酶独立的,并与诱导自噬有关,响应于一些刺激[37]-[39]。这些观察结果使我们假设 BNIP3介导 AT101刺激的 MPNST 细胞死亡。
我们首先询问在用5-20μMAT101处理24小时的 MPNST 细胞中 BNIP3蛋白水平是否增加。全细胞裂解物的免疫印迹分析表明,AT101处理以浓度依赖性方式增加 BNIP3蛋白的水平(图3A)。免疫细胞化学同样显示在 AT101处理的 MPNST 细胞中 BNIP3样免疫反应性增加(图3B)。为了确定 BNIP3蛋白的增加是否与 mRNA 的相应增加相关,我们使用定量实时 PCR 来评估用 AT101处理后 MPNST 细胞中 BNIP3 mRNA 的稳态水平。我们发现,与未处理的 MPNST 细胞相比,AT101处理导致 BNIP3 mRNA 水平显著增加(图3C)。
图3。BNIP3调节 MPNST 细胞中 AT101诱导的细胞毒性。 AT101处理的 MPNST 细胞在蛋白质印迹(A)和免疫细胞化学(B)上显示 BNIP3蛋白的浓度依赖性增加。与未处理的细胞相比,AT101处理导致 MPNST 细胞中 BNIP3 mRNA 的显著增加(C)。AT101(10μM,24小时)不显着改变 T265-2c 细胞中 BCL-2,BCL-xL,BIM,PUMA 和 BECLIN1蛋白水平的表达(D)。用针对 BNIP3的 siRNA 转染的 T265-2c 细胞在用 AT101(E)处理后显示 BNIP3蛋白水平(相对于 GAPDH 的比率)显着降低,并且相对于用非靶 siRNA 转染的细胞显着保护免于 AT101诱导的细胞死亡(F)。比例尺 = 20微米。* p-value < 0.05.
由于(-)-棉酚已被报道影响一些 BCL-2家族成员的蛋白质水平,我们检测了 AT101处理后 T265-2c 细胞中 BCL-2,BCL-xL,BIM,PUMA 和 BECLIN1的水平。我们发现这些蛋白质的水平在很大程度上不受 AT101处理的影响(图3D)。
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